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J'ai créé ce cours,
destiné à des étudiants de licence de
biologie cellulaire et physiologie de l'Université de
Picardie-Jules Verne d'Amiens, au sein du module de biologie
moléculaire, en février 2002. Il n'a pas
été remis à jour depuis.
Plan du
cours :
I- Découverte
II- Définition d’une intéine
III- Structure des intéines
IV- Mécanismes d’épissage
1- Mécanisme "classique"
2- Mécanisme alternatif
3- Trans-épissage
V- "Homing" : mobilité génique
1- Mécanisme
2- Les endonucléases de "homing"
VI- Applications technologiques et thérapeutiques
1- Les intéines : des outils pour
la recherche
2- Un espoir thérapeutique
VII- Intéines, introns catalytiques et
évolution
1- Les protéines Hedgehog
2- Processus évolutif
Contenu
du cours :
Transparent 1 : Plan du cours
I - Découverte
1 - La découverte des
intéines (1990)
: le gène TFP1 de Saccharomyces cerevisiae
Transparent 2.1 :
le gène TFP1 de Saccharomyces cerevisiae
le gène TFP1 de la levure Saccharomyces
cerevisiae code la sous-unité catalytique de l'ATPase
vacuolaire
la protéine a une taille de 69 kDa
or, la région codante
présente dans l'ADN et l'ARNm de TFP1 correspond
à une taille protéique de 119 kDa
comparaison avec le gène de l'ATPase vacuolaire d'autres
organismes
=> la région codante de TFP1 de S. cerevisiae
est interrompue par 454 codons de séquence sans aucun rapport
la délétion de ces codons non-apparentés permet
l'obtention d'une protéine de 69 kDa fonctionnelle
il ne s'agit pas d'un épissage de l'ARNm
l'expression du gène TFP1 dans une bactérie
aboutit à l'obtention d'une protéine de 119 kDa
non-fonctionnelle
en fait, la protéine traduite comprend une séquence
intercalaire (de 50 kDa), qui est épissée peu de temps
après
la traduction, de façon à produire une protéine de
69 kDa fonctionnelle
2 - Le gène pol
de Pyrococcus
Transparent 2.2 :
le gène pol de Pyrococcus
Pyrococcus est une bactérie
thermophile extrême (elle vit à une température
supérieure à 95°C)
dans le gène codant son ADN polymérase, découverte
d'une séquence supplémentaire au niveau de la
région codante, similaire à celle du gène TFP1
de S.
cerevisiae
cette séquence a été
appelée intéine pour "internal protein"
(protéine interne)
les séquences codantes du gène ont été
nommées N-extéine et C-extéine ("external
protein")
une expérience a été réalisée afin
de comprendre comment est épissée l'intéine :
constuction d'une protéine de
fusion :
une protéine N-terminale - l'intéine de Pyrococcus
- une protéine C-terminale
cette protéine de fusion a été
synthétisée dans la bactérie Escherichia coli
(croissance à 37°C), puis purifiée
=> isolement de la protéine précurseur non
épissée (car la température n'était pas
adéquate)
in vitro, à une température
élevée, sans ajout d'autre protéine ni de
co-facteur, la protéine de fusion est épissée
=> auto-épissage de l'intéine (l'intéine est
capable de s'épisser elle-même des extéines)
pendant la réaction de clivage, observation d'un
intermédiaire branché, pourvu de deux
extrémités N-terminales (celle de la N-extéine et
celle de l'intéine)
ce mécanisme rappelle l'épissage des
introns catalytiques de groupe I :
- auto-épissage (toute
l'information nécessaire
à l'épissage est contenue dans l'intron)
- intermédiaire de branchement (lasso)
II - Définition
d'une intéine
Transparent 3 :
définition des intéines
1 - Définition
intéine = segment interne d'une
protéine, retiré post-traductionnellement par un
processus d'épissage,
suivi de la ligation des deux fragments externes (les extéines)
par
une véritable liaison peptidique
Transparent 4 :
l'épissage protéique s'effectue post-traductionnellement
l'intéine correspond à un intron protéique
Transparent 5 :
comparaison de l'épissage des protéines et des ARN
le mécanisme d'excision de l'intéine, suivi de la
ligation des extéines, est nommé épissage
protéique
la ligation des extéines différencie l'épissage
protéique de l'auto-protéolyse effectuée par
certaines protéines
les intéines possèdent des motifs de séquence
particuliers, qui les distinguent de simples variations de
séquence entre deux allèles ou entre deux
protéines homologues d'organismes différents
quatre critères permettent de définir une intéine :
- insertion en phase, dans la
région
codante d'un gène, dont un gène homologue est
dépourvu
- la taille de la protéine mature est
similaire à celle des homologues dépourvus
d'intéine, mais inférieure à la taille
prédite d'après la région codante du gène
- présence de blocs conservés de
séquence
- présence de résidus conservés
au niveau des jonctions d'épissage
2 - Distribution
à ce jour, 130 intéines ont
été identifiées d'après ces critères
mais, il en existe seulement 12 pour lesquelles l'auto-catalyse de
l'épissage a été démontrée
(mis à part une exception, lorsque l'on a recherché
à démontrer l'auto-épissage, cela s'est
avéré exact)
des intéines ont été identifiées dans
presque tous les règnes de la vie :
- archaebactéries
- eubactéries
- eucaryotes inférieurs (algues, levure),
dans le noyau et les organites
- virus d'eucaryotes supérieurs
- bactériophages
il n'y a que chez les eucaryotes supérieurs
qu'aucune intéine n'a été identifiée
les intéines sont généralement localisées
dans des gènes essentiels à la vie de l'organisme
principalement, dans des gènes codant des protéines
du métabolisme de l'ADN
(ADN polymérase, hélicase, gyrase, recombinase,
ribonucléotide réductase)
parfois, dans des gènes codant des protéines du
métabolisme énergétique
le plus souvent, il n'y a qu'une seule intéine par
protéine
chez les Archaebactéries, on connait des gènes
possédant deux, voire trois, intéines
dans la protéine hôte, l'intéine est située
au niveau de régions importantes pour l'activité de la
protéine : site actif, poche de fixation du substrat, poche de
fixation du co-facteur
III - Structure des
intéines
1 - Deux groupes d'intéines :
intéines et mini-intéines
Transparent 6.1 :
intéines et mini-intéines
une intéine est
composée de trois domaines :
- une région d'épissage
N-terminale (100 résidus)
- le domaine endonucléase (intéine) ou
un espaceur (mini-intéine)
- une région d'épissage C-terminale
(< 50 résidus)
l'endonucléase permet la mobilité
génique de l'intéine (voir chapitre V), mais ne participe
pas au mécanisme d'épissage protéique
les deux régions d'épissage forment un domaine
fonctionnel unique, au niveau de la structure tri-dimensionnelle de
l'intéine
intéine : 75 % des intéines
présence d'un domaine endonucléase
300-600
résidus
mini-intéine : 25 % des intéines
absence du domaine
endonucléase
130-200 résidus
2 - Les motifs conservés des
intéines
Transparent 6.1 :
intéines et mini-intéines
les intéines présentent plusieurs motifs de
séquence conservés :
- motifs A et B dans la
région d'épissage N-terminale
- motifs F et G dans la
région d'épissage C-terminale
- motifs N2 et N4 (nettement moins conservés)
dans la région d'épissage N-terminale
- motifs C, D, E et H des endonucléases
(dans le cas des intéines à endonucléases)
3 - Les résidus conservés des
intéines
Transparent 6.2 : motifs
conservés
les séquences des jonctions d'épissage des
intéines sont similaires entre-elles
convention de numérotation :
intéine
de 1 à x
de N-ter vers C-ter
N-extéine de -1 à
-x en s'éloignant de l'intéine (C-ter
vers N-ter)
C-extéine de +1 à
+x en s'éloignant de l'intéine (N-ter
vers C-ter)
le premier résidu de l'intéine est
presque toujours une cystéine (parfois, une sérine ou une
alanine)
les deux derniers résidus de l'intéine sont
généralement histidine-asparagine (parfois,
histidine-glutamine)
le premier résidu de la C-extéine (résidu +1) est
une cystéine, une sérine ou une thréonine
à l'intérieur de l'intéine, quelques autres
résidus sont également conservés
exemple : une histidine et une thréonine dans le motif B
cf : représentation en logos de séquences
elle est réalisée à partir d'alignements multiples
la taille de la lettre correspond à la fréquence
d'apparition du résidu
elle permet de clairement distinguer les positions ayant des
résidus conservés
4 - Les régions
nécessaires à la catalyse de l'épissage
excepté le résidu +1 de la
C-extéine, toutes les régions nécessaires à
la catalyse sont détenues par l'intéine
les résidus conservés sont ceux participant à la
catalyse
les régions minimales de l'intéine pour
l'auto-épissage sont :
- les 100 premiers résidus
N-terminaux environ (de l'extrémité N-terminale au bloc B)
- moins de 50 résidus C-terminaux (les blocs
F et G)
- le résidu +1 de la C-extéine
les domaines supplémentaires éventuels
des régions d'épissage ont deux rôles possibles :
- servir d'espaceurs, afin que
l'intéine puisse se replier et adopter une structure correcte
(flexibilité pour mettre en contact les
différentes zones participant à la catalyse)
- servir de signature, pour que la ligation se
fasse avec le bon partenaire
(surtout dans le cas du trans-épissage)
IV - Mécanismes
d'épissage
1 - Mécanisme "classique"
il ne s'agit pas du clivage des deux
liaisons peptidiques
reliant l'intéine aux extéines, puis de la
création d'une
nouvelle liaison peptidique, mais d'un réarrangement
séquentiel des liaisons chimiques sans perte de liaison
peptidique
l'épissage protéique s'effectue en quatre étapes
les trois premières étapes sont catalysées par
l'intéine, tandis que la dernière s'effectue
spontanément
* résidus impliqués
Transparent 6.2 : motifs
conservés
les principaux résidus impliqués dans la
catalyse sont des résidus nucléophiles
cf : nucléophile = ion ou molécule chargé
négativement, et donc susceptible de donner une paire
d'électrons à un autre atome
ici, il s'agit des résidus cystéine, sérine et
thréonine-asparagine
les résidus C, S et T possèdent un groupement thiol (SH)
ou hydroxyle (OH), permettant une attaque nucléophile
=> les trois premières étapes sont des attaques par
des résidus nucléophiles
l'asparagine (ou la glutamine) est un résidu ayant une forte
propension au réarrangement spontané
=> la dernière étape est un réarrangement
spontané
des résidus capables de former des liaisons hydrogène
assistent les réactions effectuées par les
nucléophiles
Transparent 7.1 :
mécanisme classique
* première étape :
transformation de la liaison peptidique N-terminale en ester
- la jonction d'épissage N-terminale est activée par un
réarrangement acyl N-O de la sérine N-terminale (ou N-S
dans le cas d'une cystéine N-terminale)
- la N-extéine est de ce fait déplacée vers la
chaîne latérale de la sérine
- une liaison ester se forme entre entre la N-extéine et
l'intéine
cette première étape permet donc la formation de
l'intermédiaire linéaire ester (ou thio-ester dans le cas
de la cystéine)
il s'agit d'une attaque nucléophile de la liaison peptidique
par la chaîne latérale du premier résidu de
l'intéine
cette réaction est assistée par des résidus des
blocs B et G
* deuxième étape :
trans-estérification
la trans-estérification est le changement de
l'ester en un autre ester
- la liaison ester (ou thio-ester) amont est attaquée par le
groupement hydroxyle (ou thiol) du résidu +1 de l'extéine
avale (S, T ou C)
- cette attaque conduit au clivage de la liaison ester de la jonction
d'épissage N-terminale
- la N-extéine est transférée vers la chaîne
latérale du résidu +1 de la C-extéine
cette seconde étape permet la formation de
l'intermédiaire branché
la molécule a donc deux extrémités N-terminales,
celle de l'intéine et celle de la N-extéine
l'intéine et la N-extéine sont toutes deux liées
au résidu +1 de la C-extéine par :
- une liaison peptidique entre l'intéine et la C-extéine
- une liaison ester (ou thio-ester) entre la N-extéine et la
C-extéine
* troisième étape : cyclisation de
l'asparagine
- l'asparagine située à
l'extrémité C-terminale de l'intéine se cyclise
=> formation d'un cycle succinimide
- ceci entraîne la clivage de la jonction d'épissage
C-terminale
=> - libération de l'intéine
- la N-extéine et la C-extéine
sont toujours liées par une liaison ester
cette réaction est assistée par l'avant-dernière
histidine de l'intéine
* quatrième étape : transition O-N
- la liaison ester (ou thio-ester) entre les deux
extéines se réarrange spontanément en liaison
peptidique
c'est une transition O-N (ou O-S)
- au niveau de l'intéine épissée, le cycle
succinimide C-terminal se réarrange spontanément en
asparagine ou isoasparagine
* cas de la présence d'une glutamine
C-terminale
Transparent 7.2 :
formation d'un cycle succinimide (Asn) ou glutarimide (Gln), par
déamidation
certaines intéines ont une glutamine (Q) C-terminale à la
place de l'asparagine
comme l'asparagine, la glutamine est capable de se cycliser par
déamidation, pour former un cycle glutarimide
le mécanisme d'épissage est donc le même
2 - Mécanisme alternatif
certaines intéines ont une alanine en
position N-terminale (Ala1), au lieu d'une sérine ou
thréonine
elles ne peuvent donc pas effectuer la première réaction
de l'épissage protéique (réarrangement acyl N-O ou
N-S)
cependant, elles sont capables de s'épisser par un
mécanisme alternatif
Transparent 7.3 : le mécanisme alternatif des
intéines à Ala 1 N-terminale
* mécanisme alternatif
des intéines à Ala1
le nucléophile +1 de la C-extéine
(cystéine, sérine ou thréonine) attaque la liaison
peptidique de la
jonction d'épissage N-terminale
=> formation de l'intermédiaire
branché
cf : dans le mécanisme classique, c'est dans
la seconde étape que le résidu +1 attaque la liaison
ester
de la jonction d'épissage N-teminale
=> dans le mécanisme alternatif, ces deux
étapes sont réalisées en une seule
le reste du mécanisme est identique
* pourquoi est-ce-que toutes les intéines
n'utilisent-elles pas ce mécanisme, qui semble plus simple ?
la première étape
du
mécanisme classique (formation de l'intermédiaire ester)
doit
être nécessaire pour induire un changement conformationnel
permettant
l'attaque nucléophile par le résidu +1 de la
C-extéine
(ce résidu est trop éloigné pour attaquer
directement la liaison peptidique)
dans les intéines à Ala1, le résidu +1 est
déjà en position pour attaquer la jonction
d'épissage N-ter
(des différences de séquence de l'intéine lui
permettent d'adopter une conformation adéquate)
3 - Trans-épissage
Transparent 7.4 : le
trans-épissage des intéines
* le mécanisme de trans-épissage
des intéines est similaire à celui des introns
les deux fragments de l'intéine sont
codés dans des régions séparées du
génôme
la transcription et la traduction de chaque fragment
sont séparées
après la traduction, les deux fragments de
l'intéine s'associent et se replient
l'épissage protéique a alors lieu par
un mécanisme classique
=> protéine hôte + intéine
* actuellement, une seule intéine
épissée en trans a été identifiée
par contre, de nombreuses intéines épissant en trans ont
été construites pour des applications technologiques ou
thérapeutiques
V - "Homing" :
mobilité génique
Le homing, ou mobilité génique,
est le transfert d'une intéine d'un
allèle à un allèle homologue dépourvu de
l'intéine (même gène hôte).
C'est un mécanisme particulier de transposition.
Le phénomène et le mécanisme de mobilté
génique des intéines sont similaires à ceux se
produisant pour certains introns catalytiques.
1 - Mécanisme
Transparent 8.1 : la
mobilté génique
* Un gène dépourvu d'une
intéine se retrouve dans la même cellule qu'un gène
homologue dépourvu d'intéine.
circonstances : - méïose
- infection virale, bactérienne ou par
un bactériophage
-
conjugaison bactérienne
-
transformation
- ...
* Il y a transcription et traduction du gène
portant l'intéine, puis épissage protéique.
=> libération de la protéine
hôte et de l'intéine
* La majorité des intéines
possèdent un domaine endonucléase.
L'endonucléase ne participe pas à
l'épissage protéique, mais est responsable du homing.
* L'endonucléase reconnait l'ADN- cible
(même position dans le gène homologue que dans le
gène hôte).
Elle effectue alors un clivage double-brin de l'ADN au
niveau, ou à proximité, du site d'insertion de
l'intéine.
* Cette cassure double-brin induit l'intervention d'un
système de réparation des cassures de l'ADN par
recombinaison homologue.
La seule copie du gène restant pour servir de
matrice pour la réparation est le gène comprenant
l'intéine.
=> réparation du gène clivé en
utilisant le gène porteur de l'intéine comme matrice
=> duplication de l'intéine, qui est ainsi
intégrée dans un nouveau gène
* une intéine ne peut être
intégrée qu'à une position dépourvue de
l'intéine
car la présence de l'intéine interrompt
la séquence reconnue par l'endonucléase
(=> plus de reconnaissance)
* l'intéine est donc un élément
génétique mobile
elle tire partie des mécanismes de
réparation de l'ADN de l'hôte pour se propager
elle est de ce fait un élément parasite
elle est capable de s'auto-épisser, et n'est
donc pas néfaste pour l'organisme-hôte
2 - Les endonucléases de "homing"
Transparent 8.2 : les
endonucléases de "homing"
* Les endonucléases responsables du homing sont
communes aux intéines et aux introns catalytiques mobiles.
* Comme les enzymes de restriction, elles
reconnaissent spécifiquement une séquence de l'ADN et y
effectuent des clivages double-brin.
mais : - les sites de reconnaissance de l'ADN sont de
grande taille (12-40 pb)
=> très grande
spécificité (le site de reconnaissance n'est
présent qu'une ou deux fois dans un génome, de sorte que
cela ne perturbe pas le génome de l'organisme hôte)
- les sites sont
asymétriques
- il existe une
tolérance vis-à-vis d'un changement de base
=> cela leur permet de
s'intégrer dans un gène homologue d'un autre organisme,
malgré l'existence de petites différences de
séquence
* Les régions d'épissage de
l'intéine n'interviennent pas dans la mobilité
tout comme le domaine endonucléase n'intervient
pas dans l'épissage
* En plus du domaine endonucléase, certaines
intéines ont un domaine supplémentaire de liaison
à l'ADN.
=> affinité plus grande pour l'ADN
* 4 familles d'endonucléases :
elles sont communes aux introns
catalytiques et aux intéines
elles sont définies selon
des motifs de séquence conservés
il s'agit des endonucléases
LAGLIDADG, HNH, GIY-YIG et His-Cys
pour l'instant, seules des endonucléases
LAGLIDADG et HNH ont été identifiées dans des
intéines
les quatre familles
d'endonucléases existent chez les introns catalytiques
la majorité des
endonucléases des intéines sont de la famille LAGLIDADG
- les endonucléases LAGLIDADG
Transparent 8.3 : les
endonucléases LAGLIDADG (1)
Transparent 8.4 : les
endonucléases LAGLIDADG (2)
elles sont également appelées
endonucléases DOD, pour dodécapeptide, car elles
contiennent une séquence de 12 résidus conservés,
dont le motif LAGLIDADG
les endonucléases des intéines ont
toujours deux motifs LAGLIDADG, distants de 80-150 résidus, de
sorte que cette enzyme, qui est active sous forme de monomère,
adopte une structure pseudo-dimérique
domaine I :
extrémités N et C terminales de l'intéine
19
feuillets beta et 2 hélices alpha
domaine II : 2 motifs abbabba
symétrique
4 motifs conservés : C, D, E et H
C et E correspondent aux motifs LAGLIDADG
les deux domaines LAGLIDADG interagissent pour
former le site actif de l'endonucléase
ces domaines assurent également la fixation
d'un ion Mg2+, qui est le co-facteur de la réaction
de clivage de l'ADN
les endonucléases LAGLIDADG se fixent
spécifiquement à une séquence d'une trentaine de
nucléotides de l'ADN
les régions d'épissage participeraient
légèrement à la fixation de l'ADN (contacts
non-spécifiques de faible affinité)
une des caractéristiques des
endonucléases LAGLIDADG est que leur fixation induit une forte
torsion de la double-hélice d'ADN (de 60° à 90°),
qui facilite le clivage
cette liaison permet d'une part d'accommoder l'ADN
à la forme de la protéine (d'où un meilleur
contact), et d'autre part de positionner les liaisons
nucléotidiques qui seront clivées au niveau du site actif
de l'endonucléase
le clivage de l'ADN s'effectue au niveau du site
d'insertion de l'intéine
motif Histidine-Asparagine-Histidine
(H-N-H)
elles comportent une séquence
conservée d'une trentaine de résidus, dont le motif HNH
elles forment ainsi un domaine en doigts de zinc,
permettant la liaison à l'ADN
(comme les facteurs de transcription à doigts
de zinc)
- les endonucléases GIY-YIG
ce sont des protéines de petite
taille
elles comportent un motif :
Glycine-Isoleucine-Tyrosine-(10-11
résidus)-Tyrosine-Isoleucine-Glycine
G-I-Y-(X)10-11-Y-I-G
elles reconnaissent une séquence de l'ADN de
grande taille (> 30 pb)
le site de clivage de l'ADN est
éloigné du site d'insertion de l'intéine
- les endonucléases His-Cys
elles sont caractérisées par
une série d'histidines et cystéines, comprise dans une
région centrale d'environ 100 acides aminés
* Comme les endonucléases de homing sont
présentes à l'intérieur d'une autre
protéine (ce sont des protéines intercalaires),
l'intéine, il y a des contraintes au niveau de la
longueur de leur région codante (qui doit être de petite
taille),
ce qui limite leur stucture tridimensionnelle.
VI - Applications technologiques
et thérapeutiques
Transparents
:
1 - Plan
2 - Découverte
des intéines
2.1 - Le gène TFP1 de Saccharomyces
cerevisiae
2.2 - Le gène pol de Pyrococcus
3 - Définition
des intéines
4 - L'épissage
protéique s'effectue post-traductionnellement
5 - Comparaison de
l'épissage des protéines et des ARN
6 - La
structure des intéines
6.1 - Intéines et mini-intéines
6.2 - Motifs conservés
7 - Les
mécanismes d'épissage
7.1 - Le mécanisme classique
7.2 - La formation d'un cycle succinimide (Asn) ou
glutarimide (Gln), par déamidation
7.3 - Le mécanisme alternatif des intéines
à Ala 1 N-terminale
7.4 - Le trans-épissage des intéines
8 - Le
"homing" : mobilité
génique
8.1 - La mobilité génique
8.2 - Les endonucléases de "homing"
8.3 - Les endonucléases LAGLIDADG (1)
8.4 - Les endonucléases LAGLIDADG (2)
9 - Les
intéines : des outils pour la recherche
10 - Les
intéines comme outils de biochimie et de biologie
moléculaire
10.1 - La ligation protéique par
trans-épissage
10.2 - La purification de protéines par
étiquette d'affinité auto-clivable
10.3 - Criblage et visualisation d'interactions
protéiques in vivo
11 - Applications
thérapeutiques
11.1 - La thérapie mitochondriale (1)
11.2 - La thérapie mitochondriale (2)
12 - Les
protéines Hedgehog
12.1 - Les protéines Hedgehog (Hh)
12.2 - Le mécanisme d'auto-protéolyse
d'Hedgehog
12.3 - Le module HINT : l'ancêtre commun de
Hedgehog et des intéines
13 - Processus
évolutif
14 - Distribution
des intéines
parmi les génomes complètement séquencés
15 - Distributions
phylogénétique et génique des intéines et
introns
Polycopié
:
Bibliographie
:
- InBase
: le site dédié aux intéines de New England Biolabs
- un fichier
compressé (18,9 Mo), à télécharger,
comprenant 42 articles
scientifiques (de 1995 à 2002) sur les intéines
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