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Le proto-oncogène c-myc code un facteur de transcription, impliqué dans les processus de prolifération et de différenciation cellulaires, et d'apoptose. Son ARNm est normalement très instable, ce qui limite le taux de synthèse de l'oncoprotéine. De ce fait, la modification de la stabilité de ce messager serait à l'origine du développement d'un certain nombre de tumeurs (lymphomes de Burkitt, plasmocytomes, tératocarcinomes).

La régulation de la stabilité de l'ARNm c-myc a été particulièrement étudiée in vitro. Les résultats obtenus suggèrent que l'instabilité du transcrit est due aux éléments riches en A et U (ARE pour adenosin-rich element ) situés dans la région 3' non traduite (3'UTR), mais aussi à une séquence localisée à la fin de l'exon III. Les données issues d'analyses in vivo sont peu nombreuses. Elles mettent en évidence l'importance de trois domaines de l'ARNm : l'exon II, l'exon III, et la région 3'UTR.
Peu d'éléments relatifs aux facteurs et aux mécanismes de contrôle de la stabilité sont actuellement connus.

Un système hétérologue d’étude de la régulation post-transcriptionnelle des gènes

Dans le but d’étudier les régions impliquées dans la régulation post-transcriptionnelle du gène c-myc in vivo, l’équipe du Pr Signoret a mis au point un système hétérologue, selon lequel les ARNm de xénope (Xenopus laevis) sont injectés dans le cytoplasme d'ovocytes d'une autre espèce d'amphibien, l'axolotl (Ambystoma mexicanum) ; le devenir de ces molécules de xénope dans la cellule hôte est ensuite étudié.
Cette méthode permet l'analyse des mécanismes post-transcriptionnels, en excluant les processus transcriptionnels auxquels pourraient être soumis les ARN endogènes (1). L’emploi de ce système a permis de mettre en évidence une régulation post-transcriptionnelle différentielle selon le stade ovocytaire (stades III-IV : ovocytes en croissance ; stade VI : ovocytes âgés ; ovocytes matures : ovocytes pour lesquels la progestérone a induit le déversement du contenu nucléaire dans le cytoplasme, GVBD) (1 et 2).

Des régions différentes de l’ARNm c-myc sont responsables de la régulation différentielle de sa stabilité

Afin de préciser la localisation de ces régions, nous avons synthétisé des transcrits c-myc de xénope, délétés au niveau de la séquence codante et/ou du 3'UTR. Nos résultats suggèrent que trois régions sont impliquées dans la stabilité lorsque l'ARNm c-myc de xénope est injecté dans le cytoplasme d'ovocytes d'axolotl en fin de croissance (stade VI) : les 278 premiers nucléotides de l'exon II, les 177 derniers nucléotides de l'exon III, et 125 bases situées dans la moitié 5' de la région 3'UTR ; ceci serait dû à la fixation d’un facteur cytoplasmique.

D'autre part, au moins deux régions contribueraient à l'instabilité de l'ARNm c-myc lors de la maturation ovocytaire, par l'intervention d’une protéine nucléaire, déversée dans le cytoplasme lors de la rupture de la vésicule germinative (GVBD) se produisant lors de la maturation ovocytaire. Il s’agit des 278 premiers nucléotides de l'exon II, et de 312 bases situées dans la moitié 3' du 3'UTR. A contrario, le domaine de 125 bases du 3’UTR participe à la stabilisation de ce messager. Des expériences de co-injection indiquent que la formation d’une structure secondaire entre la moitié 5’ du 3’UTR et la région codante serait également responsable d’une stabilisation de l’ARNm c-myc dans les ovocytes matures (3).

Les sites de l’ARNm c-myc régulant sa stabilité

A – L’analyse in vivo de la stabilité des transcrits c-myc de xénope dans le cytoplasme d’ovocytes de stade VI d’axolotl a permis de localiser trois domaines protecteurs, sites de liaison de facteurs cytoplasmiques.

B – Lors de la maturation ovocytaire, des facteurs nucléaires sont déversés dans le cytoplasme. Leurs sites de liaison à l’ARNm c-myc sont représentés.

Les sites de liaison de facteurs protecteurs sont symbolisés par des tubes de colle, tandis que les domaines de reconnaissance de facteurs déstabilisants sont représentés par des paires de ciseaux.

Pour définir plus finement les séquences ou les motifs responsables du contrôle de la stabilité de cet ARNm, une banque de délétions progressives unidirectionnelles de l'ADNc c-myc de xénope a été réalisée. A partir de ces ADN délétés, des transcrits pourront être synthétisés puis injectés dans le cytoplasme d'ovocytes d'axolotl. Les clones ainsi obtenus portent des délétions susceptibles d'affiner les résultats déjà obtenus.

(1) Andéol Y., Lefresne J., Houillon C. and Signoret J. (1995) Differential stability of Xenopus c-myc RNA during oogenesis in axolotl - Involvment of the 3'UTR in vivo . Roux's Arch Dev Biol 205, 182-91
(2) Andéol Y., Lefresne J. and Signoret J. (1995) Evidence for a nuclear factor involved in c-myc RNA degradation during axolotl oocyte maturation. Roux's Arch Dev Biol 205, 192-7
(3) Lefresne J., Lemaître J.M., Sélo M., Goussard J., Mouton C. and Andéol Y. (2001) Evidence for multiple sequences and factors involved in c-myc RNA stability during amphibian oogenesis. Development Growth & Differentiation 43(2), 195-211 (PubMed) (Dev. Growth. Differ.)

Les nucléoside diphosphate kinases : des protéines aux fonctions énigmatiques

Les Nucléoside Diphosphate Kinases (Nm23/NDPK) sont des enzymes du métabolisme de base codées par une famille de gènes. Huit protéines NDPK sont actuellement connues chez l’homme, dont deux sont très abondantes et ubiquitaires (Nm23-H1/NDPK A et Nm23-H2/NDPK B), tandis que les six autres ont un profil d’expression plus ou moins spécifique. Outre leur fonction “de ménage” dans le métabolisme des nucléotides, elles seraient également impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques, telles que la prolifération, la différenciation, le vieillissement et les migrations cellulaires, l’apoptose, la transduction des signaux, la régulation de l’expression de gènes, le développement embryonnaire et la suppression des métastases de certains cancers. Plusieurs activités potentielles de ces protéines seraient susceptibles de rendre compte de ces implications variées, telles que la phosphorylation des nucléotides et des protéines, la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle de l’expression génique et l’établissement de nombreuses interactions protéiques. Toutefois, les résultats sont parfois contradictoires, les mécanismes moléculaires restent hypothétiques et il n’est pas certain que toutes ces activités et fonctions, décrites in vitro , existent dans l’organisme.

La sur-expression des NDPK inhibe la migration cellulaire lors de l’embryogenèse du xénope

Chez l’amphibien Xenopus laevis, trois isozymes de la NDPK ont été isolés, correspondant aux NDPK A et B humaines (1). Leur distribution au cours de l’oogenèse et l’embryogenèse a été analysée ; elle suggère une implication des NDPK dans le devenir cellulaire, ainsi qu’une fonction particulière de chacune d’entre-elles (2). Je me suis attachée à déterminer les fonctions des NDPK au cours de l’embryogenèse de l’amphibien Xenopus laevis.

J'ai ainsi montré qu’au cours du développement embryonnaire la surabondance de NDPK, humaine et de xénope, perturbe le devenir (induction mésodermique) et la migration (inhibition de l’invagination de l’endoderme à la gastrulation) cellulaires. Les phénotypes des individus résultant de ces expériences ont été caractérisés pour tous les stades du développement précoce.

Les protéines Nm23 semblent perturber la transition épithélium-mésenchyme

L’analyse du phénotype de ces embryons me permet de penser que ces effets des NDPK s’effectuent par l’action sur la transition épithélium-mésenchyme (TEM), mécanisme intervenant à la fois dans plusieurs évènements développementaux (migrations cellulaires des cellules endodermiques lors de la gastrulation, notamment) et dans l’initiation du processus métastatique. Des études préliminaires, réalisées sur des calottes animales d’embryons de xénope, semblent confirmer cette hypothèse. J'envisage ensuite de définir au niveau de quels évènements de la TEM, et de quelles molécules, interviennent les protéines Nm23. Ces résultats, s’ils aboutissent, devraient donner lieu à une première publication.

Les protéines Nm23 n’interfèrent pas avec la voie des MAP kinases

Lors de la maturation oocytaire, j'ai démontré que, contrairement à des résultats publiés récemment, la sur-expression des protéines Nm23, humaines et de xénope, à des doses physiologiques ne perturbe pas la voie des MAP kinases (collaboration avec l’équipe du Dr C. Jessus, Paris).

L’activité NDPK n’est pas impliquée dans l’inhibition de la migration cellulaire par Nm23-H1

L’injection de différentes protéines NDPK humaines, sauvages ou mutées pour certaines fonctions (activités enzymatique, de liaison à l’ADN), m'a permis de confirmer, par analyses statistiques, qu’outre leur activité enzymatique, elles possèdent in vivo une capacité de régulation des gènes et d’autres propriétés encore indéfinies. Plusieurs hypothèses ont été testées (interaction avec les intégrines, régulation de la voie des MAP kinases), mais elles n’ont malheureusement pas donné de résultats interprétables. De plus, j'ai établi que la sur-abondance de Nm23-H1 interfère avec la migration cellulaire à la gastrulation, peut-être en inhibant la TEM. Son activité enzymatique semble indispensable à l’induction et/ou l’initiation de la gastrulation, mais n’intervient pas dans l’inhibition de la migration cellulaire.

Nm23-H2 inhibe les divisions cellulaires en régulant l’expression génique

D’autre part, la sur-abondance de Nm23-H2 perturbe les divisions cellulaires de la segmentation, et l’initiation de la gastrulation. Ces effets sont indépendants de l’activité enzymatique, et impliquent sa capacité de régulation transcriptionnelle .

L'ensemble des résultats obtenus me permet donc de déterminer quelles fonctions des NDPK sont impliquées au cours du développement embryonnaire, et ainsi de définir quelles activités existent réellement in vivo. Ces données peuvent être mises en relation avec l’intervention supposée de ces deux protéines dans la tumorigenèse et la cascade métastatique. J'ai ainsi pu confirmer et préciser les données issues de tests cliniques et d’expériences in vitro. Il s’agit des premières données fonctionnelles obtenues in vivo chez un organisme vertébré ; des expériences similaires, effectuées depuis peu chez la souris, corroborent nos conclusions (J.-Y. Daniel, communication personnelle, article en préparation). Ces résultats ont donné lieu à une publication (3, manuscrit soumis).

Clonage de l’ensemble des ADNc nm23 de Xenopus laevis

Par ailleurs, j'ai caractérisé les ADNc spécifiant les autres protéines NDPK de xénope (XDR-Nm23, Nm23-X4, X5, X6, X7 et X8), à partir des étiquettes (EST) présentes dans les banques de données. J'ai réalisé des analyses de séquence sur chacun d’entre-eux, et procédé à une analyse phylogénétique .

Etablissement des profils d’expression des gènes nm23 au cours de l’oogenèse, l’embryogenèse, la métamorphose et la vie adulte

Nous terminons actuellement l’étude comparative de leurs profils d’expression, par RT-PCR semi-quantitative, au cours de l’oogenèse, l’embryogenèse et la métamorphose du xénope, ainsi que dans différents tissus de l’individu adulte. Les données obtenues suggèrent une spécialisation fonctionnelle de certains membres de la famille Nm23 ; en particulier, les produits des gènes XDR-nm23 , nm23-X4 et nm23-X7 interviendraient dans les évènements de remaniements de tissus spécifiques au cours de la métamorphose , tandis que le facteur Nm23-X8 participerait à la fonction testiculaire. Ces résultats constituent la première analyse, exhaustive et comparative, de l’expression des gènes nm23 ; ils donneront prochainement lieu à une troisième publication, actuellement en cours de rédaction (4).

Par la suite, une analyse fonctionnelle, au moyen d’expériences de sur-expression, de transgenèse et d’expression de mutants dans les embryons de xénope, devrait permettre de définir les implications de chaque facteur Nm23/NDPK au cours du développement embryonnaire et de la métamorphose.

(1) Ouatas T., Abdallah B., Gasmi L., Bourdais J., Postel E. and Mazabraud A. (1997) Three different genes encode NM23 nucleoside diphosphate kinases in Xenopus laevis. Gene 194 : 2, 215-25 ( PubMed )

(2) Ouatas T., Sélo M., Sadji Z., Hourdry J., Denis H. and Mazabraud A. (1998) Differential expression of nucleoside diphosphate kinases (NDPK/NM23) during Xenopus early development. Int J Dev Biol 42, 43-52 (PubMed) (Article en pdf)

(3) de Chalendar M. Nm23-H1 and Nm23-H2 repress cell migration and proliferation, respectively, in Xenopus embryos independently of their nucleoside diphosphate kinase activity. (soumis)

(4) de Chalendar M., du Pasquier D. and Mazabraud A. Virtual cloning, characterization and functional expression of six nm23 factors of Xenopus laevis. (en préparation)

1998	Differential expression of nucleoside diphosphate kinases (NDPK/NM23) during Xenopus early development Ouatas T., Sélo M., Sadji Z., Hourdry J., Denis H. and Mazabraud A. International Journal of Developmental Biology, 1998, 42 : 43-52 (PubMed) (Article en pdf)
2001	Evidence for multiple sequences and factors involved in c-myc RNA stability during amphibian oogenesis Lefresne J., Lemaître J.M., Sélo M., Goussard J., Mouton C. and Andéol Y. Development Growth & Differentiation, 2001, 43 (2) : 195-211 (PubMed)
2002	Nm23-H1 and Nm23-H2 repress cell migration and proliferation, respectively, in Xenopus embryos independently of their nucleoside diphosphate kinase activity de Chalendar M. (soumis)
2002	Virtual cloning, characterization and functional expression of six nm23 factors of Xenopus laevis de Chalendar M., du Pasquier D. and Mazabraud A. (en préparation)

1996	Two different regions of the 3'UTR are involved in the stability of the c-myc mRNA during oogenesis in axolotl Sélo M., Lefresne J., Mouton C., Signoret J. and Andéol Y. International Journal of Developmental Biology, 1996, 40 , n°3 : 38S
1997	Functional role of nucleoside diphosphate kinase during development and oncogenesis Ouatas T., Hourdry J., Sélo M. and Mazabraud A. International Journal of Developmental Biology, 1997, 41, n°5 : 25S

au Centre de Génétique Moléculaire du CNRS (Gif-sur-Yvette)
à l’Institut de Biologie Animale Intégrative et Cellulaire de l’Université Paris XI (Orsay), au sein du laboratoire Transgenèse et Génétique des Amphibiens.